L’équipe «Machines moléculaires à ARN et santé humaine» est spécialisée dans la biologie structurale des protéines et des ARN, et de leurs complexes avec de petites molécules.
Notre groupe est impliqué dans trois thèmes de recherche principaux :
(I) Biologie structurale des complexes macromoléculaires,
(II) Etudes structurales des complexes protéine-inhibiteur
(III) Cristallochimie à haute résolution de petits composés moléculaires.
Le domaine d’expertise de l’équipe est en biochimie et biologie structurale : production et purification de protéines et d’ARN, étude structurale (cristallographie, SAXS, microscopie cryoélectronique…) et l’analyse fonctionnelle (tests d’interactions biophysiques et biochimiques, fluorescence, enzymologie,… )
1 – Biologie structurale et fonctionnelle intégrative des mécanismes moléculaires à ARN
Notre projet principal vise à déchiffrer les mécanismes moléculaires des machines moléculaires à ARN.
Les ribonucléoprotéines (RNP) sont des complexes composés de protéines et d’ARN qui jouent un rôle crucial dans la cellule. Ces RNP sont impliquées dans un large éventail de fonctions cellulaires et biochimiques, de la maturation de différentes classes d’ARN à la synthèse des protéines. Elles correspondent ainsi à certaines des machines moléculaires les plus complexes. Notre intérêt consiste à comprendre comment ces machines moléculaires sont assemblées et régulées dans la cellule.
Au cours de ces dernières années, nous avons contribué à la compréhension de la biogenèse de RNP en utilisant la biologie structurale pour déterminer la structure des protéines impliquées dans ces processus d’assemblage. Nous avons ciblé plusieurs aspects différents de la maturation de RNP en mettant l’accent sur les petits complexes protéiques qui sont des éléments constitutifs essentiels.
2 – Biogenèse des ribosomes : une cible prometteuse dans les thérapies contre le cancer
Lors de la tumorigenèse, les cellules cancéreuses doivent proliférer. L’un des premiers changements dans au sein des cellules est la dérégulation de la biogenèse des ribosomes, qui conduit à une plus grande quantité de ribosomes et à une traduction accrue. Les dernières années ont vu la découverte d’un lien étroit entre la biogenèse des ribosomes et le contrôle du cycle cellulaire, avec des mécanismes impliquant l’interaction directe des facteurs d’assemblage des ribosomes avec le régulon p53. Plusieurs études ont mis en évidence que l’inhibition à différents niveaux de la biogenèse des ribosomes conduit à la stabilisation et à l’accumulation de p53, et que cette régulation est perturbée dans les cellules cancéreuses.
Le projet repose sur l’hypothèse que le ciblage de la voie de régulation de la biogenèse des ribosomes / p53 (RB / p53) est une alternative intéressante et complémentaire au ciblage de l’interaction p53 / hDM2 pour les thérapies anticancéreuses. Nous visons à contribuer à la compréhension de la régulation de p53 par les protéines ribosomales et leurs facteurs d’assemblage, et à partir de nos résultats nous proposons de concevoir des molécules qui impactent la voie RB / p53. Ces médicaments auront un double intérêt thérapeutique dans le traitement du cancer en activant le suppresseur de tumeur p53 et en affectant la synthèse des ribosomes dans les cancers où p53 est inactivé.
Comment la régulation de l’activité de hDM2 par son association avec des protéines ribosomales au niveau moléculaire reste difficile à cerner, nous utiliserons toutes les techniques de la boîte à outils de la biologie structurale intégrative pour étudier le régulon humain RB / p53 afin d’identifier les déterminants moléculaires de l’interaction entre hDM2, p53, les protéines ribosomales et d’autres facteurs ongéniques. Outre les connaissances biologiques, cela pourrait fournir une toile structurelle pour la conception de nouvelles molécules ciblant cette voie.
3 – Complexes inhibiteurs de protéines
Notre activité en biologie structurale nous apporte fréquemment des collaborations avec des biologistes et chimistes qui souhaitent obtenir des informations structurales sur une cible biologique ou sur son interaction avec de nouveaux composés thérapeutiques. Nous sommes ouverts à des collaborations où nous sommes impliqués à différents niveaux : clonage, production et purification de protéines, études de liaison et / ou solution de structure de la protéine d’intérêt en complexe avec de petits composés moléculaires.
4 – Quelques sujets de recherche de l’équipe
4 -1- Mimétisme de l’ARN dans la biogenèse des ribosomes
Le facteur d’assemblage des ribosomes Fap7 est impliqué dans la régulation de la maturation de l’ARN ribosomal 18S et est essentiel pour l’embryogenèse et la croissance tumorale, très probablement par la voie de régulation hDM2/p53. Fap7 est particulièrement intrigant car elle interagit avec la protéine Rps14 de la petite sous-unité ribosomique et il présente une activité adénylate kinase – une fonction moléculaire plus communément associée à la régulation des niveaux d’ATP / ADP que dans l’assemblage de complexes protéine-ARN. En combinant la cristallographie, le SAXS et l’analyse biochimique du complexe Rps14 – Fap7, nous avons montré que Fap7 utilise le mimétisme avec l’ARN : les chaînes latérales des protéines imitent les contacts de l’ARN, rendant l’interaction de Rps14 avec l’ARN ribosomal ou avec Fap7 compétitive et mutuellement exclusive. Nous avons pu proposer un modèle dans lequel Fap7 utilise le mimétisme de l’ARN pour retirer temporairement Rps14 du ribosome et permet un changement conformationnel de l’ARN ribosomal qui est nécessaire pour l’étape de maturation finale de la petite sous-unité du ribosome (Loc’H et al., PloS Biology, 2013).
4 -2- Chaperonner l’assemblage de l’ARN au niveau des pré-ribosomes
L’ARN 5S est un acteur central dans l’activation de la voie p53 lors du stress nucléolaire et de la cancérogenèse. L’ARNr 5S est transcrit par l’ARN polymérase III et est assemblé dans la particule ribonucléoprotéine 5S (RNP), contenant les protéines ribosomales Rpl5 et Rpl11, avant son incorporation dans les pré-ribosomes. L’assemblage de la RNP 5S aux pré-ribosomes est effectué par un complexe spécialisé composé de Rpf2 et Rrs1. Nous avons résolu la structure du complexe Rpf2-Rrs1 seul, mais également en solution avec l’ARN 5S et placé au sein de la structure dans des cartes de cryo-EM de pré-ribosomes (T1-20). Nous avons montré que le complexe Rpf2-Rrs1 établit un réseau d’interactions qui guident l’incorporation de la RNP 5S dans les pré-ribosomes dans sa conformation initiale avant sa rotation pour former la protubérance centrale trouvée dans la grande sous-unité ribosomale mature. Afin de déchiffrer une étape précise d’assemblage des ribosomes, nous avons utilisé la cristallographie, le SAXS, la cryo-EM ainsi que des tests de liaison biochimiques protéine-ARN in vitro et in vivo (CRAC) (Madru et al., Genes Dev.2015).
4 -3- Déchiffrer la fonction des moteurs moléculaires
Les hélicases à ARN sont des moteurs moléculaires fascinants, capables de séparer les duplex d’ARN à double brin. Notre protéine modèle est Prp43, une hélicase remarquable car elle est impliquée dans différents processus biologiques (biogenèse des ribosomes, épissage,…) et nécessite des cofacteurs protéiques pour sa fonction in vitro et in vivo. Nous essayons de comprendre les déterminants moléculaires du fonctionnement de ces nanomoteurs et de leur régulation par les cofacteurs protéiques. Nous avons déjà découvert un nouveau couplage intrigant entre la fonction de déroulement nucléique et la liaison à une base nucléotidique (Robert-Paganin et al., NAR, 2017). Nous étudions actuellement la fonction par dosages moléculaires uniques en collaboration avec V. Croquette (ENS Paris).